第一節(jié) 產(chǎn)品技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

國內(nèi)一般采用生產(chǎn)技術(shù)基本如下：

選用新鮮的或冷凍保存的檢疫合格動物肝臟洗凈，剔除筋膜，加入一定比例的注射用水，用膠體磨勻漿，制得肝臟勻漿液。后將勻漿液凍存，反復凍融多次，破碎肝臟細胞，調(diào)節(jié)提取液郵值略中性，加熱使其變性，冷卻到室溫，離心得上清液，最后用超濾膜超濾離心上清液，即得HCF粗品溶液。

1、提取工藝確定：

生化原料的提取破碎方法一般有機械法、凍融法、冷熱交替法、超生波處理法、加壓破碎法、化學法、酶處理法等幾種，其中機械法.凍融法對設備環(huán)境條件要求低，并能較好地保持生化原料中天然成分的活性。有專家以胎牛肝組織為原料，分離胎肝細胞，—80℃反復凍融后勻漿，離心沉淀取上清液，用超濾法分離得中分子細胞因子（MMCF）和低分子細胞因子（LMCF），并用腫瘤細胞進行了生物效應對比 研究 。有專家也對提取過程中影響因素進行考查，確定了將新鮮小牛肝臟勻漿4次、反復凍融5次、90℃保溫5rain變性、6000分子量超濾等工藝條件，最終提取率可達到1.6%。部分專家對勻漿破碎和板框過濾的條件進行了改進，將原用的膠磨機改為分散乳化機，同時濾渣再提取時，加入注射用水中，攪拌重新板框過濾，提取量可增加40%左右。

2、肝細胞生長因子的質(zhì)量控制

促肝細胞生長素的國家制定的質(zhì)量標準中除（性狀）觀察，用pH計檢測（酸堿度），分光光度法（蛋白質(zhì)）和HPLC法（高分子物質(zhì)）、福林—酚法多肽（含量測定）、動物實驗檢測（異常毒性）、（降壓物質(zhì)）等指標。而（活力檢測）檢測成為質(zhì)量檢測的難點。

3、生物活性檢測

促肝細胞生長素的療效與其生物活性密切相關(guān)，因此其活性檢測方法是質(zhì)量控制的關(guān)鍵。由于促肝細胞生長素成分的復雜性，在檢測過程中受到多種因素的制約，尤其是現(xiàn)階段面臨生化藥物活性檢測方法改良階段，因此，尋求出高質(zhì)量、高效率、特異性強、成本低、方便快捷的活性檢測方法成為質(zhì)量生產(chǎn)控制，產(chǎn)品質(zhì)量評價和監(jiān)督的重要手段。

肝細胞生長因子活性檢測的經(jīng)典方法是3H—TdR摻入法，因靈敏度高，特異性強，可以比較客觀地量化反映包括HGF在內(nèi)的增殖活性。

促肝細胞生長素質(zhì)量標準是質(zhì)量控制的關(guān)鍵，關(guān)系到產(chǎn)品的安全性、穩(wěn)定性及有效性。由于促肝細胞生成素成分組成比較復雜，現(xiàn)行的質(zhì)量標準檢測項目比較片面，不能反映整體藥效組分和生物藥物特殊性，由于促肝細胞生長素基礎(chǔ)性質(zhì)量控制方面的 研究 比較少，特別是活性檢測方法亟待更深入的 研究 和比較，以確保質(zhì)量，最大程度上發(fā)揮藥效，確保安全性。

第二節(jié) 產(chǎn)品工藝特點或流程

促肝細胞生長素（HGF）溶液是自健康的豬或牛類新鮮肝臟中提取的具有生物活性的多肽溶液，主要成分為HGF。

1、生產(chǎn)工藝

生產(chǎn)工藝路線為：

合格的小牛肝臟準備：取新鮮小牛肝臟，目檢，表面應光滑，無任何豆狀突起，色澤為粉紅色。將合格的小牛肝臟盛裝于潔凈的塑料袋中，密封，—18℃以下冷凍保存。

新鮮小牛肝臟勻漿制備：將新鮮的小牛肝臟洗凈，剔除筋膜，切成5～10cm的小塊，按總量比例1：l（純化水：肝臟）加入純化水，在膠體磨通入冷卻水的條件下，勻漿4次，得肝臟勻漿液。

勻漿液凍融提取：將勻漿液于—18℃冷凍，凍實后，室溫緩慢化凍，完全融化后，再將其于—18℃冷凍，如此反復5次，破碎肝臟細胞，提取多肽。

提取液加熱變性：將提取液pH值調(diào)節(jié)為6.5～7.0，水浴加熱至90℃，保溫5min，冷卻至室溫，離心，得上清液。

超濾：用截留分子量為6000的超濾膜超濾離心上清液，即得HGF溶液。

2、提取方法的確定

生化原料的提取破碎方法一般有機械法、凍融法、冷熱交替法、超聲波處理法、加壓破碎法、化學法、酶處理法等幾種，其中機械法、凍融法對設備環(huán)境條件要求較低，并能較好地保持生化原料中天然成分的活性。因此，采用了機械法和凍融法聯(lián)合使用的提取方法，并對提取過程中的一些影響參數(shù)進行了比較。

勻漿次數(shù)：將切好的肝臟按總量比例1：1（純化水：肝臟）加入純化水，調(diào)節(jié)好膠體磨的最小間隙，勻漿，離心，取上清液測定多肽的含量，結(jié)果見下圖?？梢?，勻漿次數(shù)越多，粉碎效果越好，多肽提取率越高；勻漿4次時多肽含量幾乎達到最大，再增加勻漿次數(shù)，多肽含量幾乎不再增加。因此，勻漿次數(shù)選定為4次。

勻漿次數(shù)對多肽提取率的影響

凍融次數(shù)：不同的凍融次數(shù)對多肽提取率的影響見下圖。可見，凍融次數(shù)是多肽提取的一個重要因素，隨著凍融次數(shù)的增加，多肽含量幾乎呈直線上升；但5次凍融后，含量隨凍融次數(shù)增加呈減少趨勢，再增加1次凍融，多肽含量增加不大，反而會延長生產(chǎn)周期。因此，凍融次數(shù)選定為5次。

凍融次數(shù)對多肽提取率的影響

加水比例：純化水與肝臟的比例分別按0.5：1，1：l，1.5：1，2：1加入純化水，勻漿4次，凍融5次，離心取上清液，測定多肽含量，結(jié)果見下圖。可見，加水比例為l：1時，多肽提取率最大；再增大加水比例，多肽含量無明顯提高，反而會使溶液的濃度降低。因此，選用l：1的加水比例比較合理。

加水比例對多肽提取率的影響

3、加水比例對多肽提取率的影響

熱變性主要目的是使提取液中大分子蛋白質(zhì)變性沉淀而得到澄清溶液。不同溫度、不同時間的變性試驗結(jié)果見下表?？梢姡?5℃保溫15min，90℃保溫5min以上都能達到良好的變性效果，且90℃保溫5min條件下變性，保溫時間短，對溶液中有效成分破壞較小。因此，選用90℃保溫5min條件下變性較合理。

同溫度、時間的變性試驗結(jié)果

4、超濾膜的選擇

HGF溶液的國家藥品標準中高分子物質(zhì)檢查項以胰島素（分子量5800）為對照品。故選用截留分子量為6000的超濾膜進行分子截留。

5、樣品 分析

采用上述工藝 研究 確定的工藝路線，在符合GMP的生產(chǎn)車間進行了3批樣品的生產(chǎn)，按標準檢驗各項指標均符合規(guī)定，3批樣品的 分析 結(jié)果見下表。對加速試驗留樣6個月的樣品進行檢驗，各項指標與留樣前比較無明顯變化，符合標準要求。說明該工藝條件合理可行，產(chǎn)品質(zhì)量符合要求，存放期間穩(wěn)定。

3批樣品質(zhì)量 分析 結(jié)果

優(yōu)選的工藝條件是將新鮮小牛肝臟勻漿4次、反復凍融5次、90℃保溫5min變性、6000分子量超濾。通過該工藝制備的產(chǎn)品提取率能達到1.6%（多肽含量/肝臟），且各項指標均符合國家藥品標準。該工藝制備簡單，對設備要求低，適合制藥企業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

第三節(jié) 國內(nèi)外技術(shù)未來發(fā)展趨勢 分析

1、臨床應用

促肝細胞生長素及其他同類制劑因其安全，副作用少，療效較好等優(yōu)點。大量文獻報道促肝細胞生成素已作為治療各類慢性活動性肝炎、重癥肝炎。肝硬化主要的治療手段，在緩解和治療急慢性肝壞死和改善嚴重肝功能障礙的病人方面，取得了比較滿意的臨床效果晗印。最近又有 研究 顯示HGF有抗纖維化效應㈣，目前，促肝細胞生成素不僅廣泛用于肝臟疾病及其相關(guān)癥狀的治療，還能很好地保護和修復肝、肺、腎等器官的細胞，并促進器官和組織的再生和修復。此外，HGF對異源腫瘤細胞防止侵蝕或抑制增殖作用，促肝細胞生成素在胚胎肝臟和胎盤的發(fā)育中也有著顯著的作用。隨著人們對HGF日益引起的重視，促肝細胞生長素及其同類產(chǎn)品在臨床上將具有廣闊的應用前景。

盡管促肝細胞生長素及其他同類制劑具有多方面的生物效應，在臨床上應用已比較成熟，但由于純度原料及半成品標準不嚴，生產(chǎn)工藝沒有統(tǒng)一的規(guī)程不能確保產(chǎn)品質(zhì)量，純度低、雜質(zhì)含量高等不足，臨床上也偶發(fā)頭痛、發(fā)熱、頭暈等不良反應。另外， 研究 同時還發(fā)現(xiàn)高劑量的HGF能抑制人肝癌細胞的生長，小劑量則對人的某些肝癌細胞具有促進作用，所以存在著潛在用藥劑量安全等問題。為了解決上述種種問題，改善目前的生產(chǎn)工藝條件，改善產(chǎn)品的質(zhì)量迫在眉睫，從而保障臨床應用安全的可靠性、療效的有效性。

2、基因治療方面

研究 主要集中在HGF基對肝細胞和組織的功能的影響，并主要以下兩個方面進行了探索性 研究 和應用：首先是將表達HGF基因直接轉(zhuǎn)入動物模型體內(nèi)，使動物體合成較高水平的HGF，用于肝癌或肝硬化等的治療。另外用HGF作為誘導，促進肝細胞增殖和分化，便于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或腺病毒載體介導的基因?qū)耄岣呋蛑委熜?，在小鼠體內(nèi)試驗效果非常理想。目前國際上基因治療已被高度重視，功能性表達基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移載體和靶點導入給藥途徑的 研究 比較熱門，靶向給藥已成為世界性 研究 課題，肌注HGF已被動物實驗證實是安全可行的提高肝內(nèi)基因治療效率有前途的方法。這給包括急慢性肝炎、肝硬化.肝切除手術(shù)的康復等等疾病的治療帶來了曙光。

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