第一節(jié) 產(chǎn)品技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

青霉素酰化酶（penicillin acylase）在醫(yī)藥工業(yè)發(fā)揮著重要的作用，它能夠水解青霉素產(chǎn)生6-氨基青霉烷酸（6-APA），6-APA是合成青霉素的關(guān)鍵中間體。青霉素?；赣址Q為青霉素酰胺酶或青霉素氨基水解酶。該酶由2個(gè)亞基組成：20～23kDa的含有側(cè)鏈結(jié)合位點(diǎn)的亞基和65 69kDa的含有催化位點(diǎn)的亞基。

目前應(yīng)用最多的是由大腸桿菌和巨大芽孢桿菌產(chǎn)生的青霉素?；?。

近年來的 研究 傾向于3個(gè)方面：利用物理或化學(xué)誘變方法、基因工程方法對(duì)產(chǎn)青霉素?；傅木赀M(jìn)行改造，突變菌種的分離以及酶在不同的產(chǎn)酶宿主細(xì)胞中的克隆和表達(dá)。如利用紫外光誘變巨大芽孢桿菌可以獲得酶產(chǎn)量增加4 倍的突變菌株，利用重組DNA技術(shù)將編碼青霉素?；傅幕?qū)胨拗骷?xì)胞中，構(gòu)建了高產(chǎn)分泌型工程菌。

我國從70年代就 研究 和開發(fā)將青霉素?；赣糜诎牒铣煽股氐纳a(chǎn)中，但是，到目前為止，除了6-APA的生產(chǎn)外，其他產(chǎn)品均未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。國外雖然有廠家（如DSM）在β-內(nèi)酰胺抗生素生產(chǎn)的全過程均實(shí)現(xiàn)了酶法生產(chǎn)，但是由于對(duì)我國實(shí)行的技術(shù)封鎖，我們拿不到核心技術(shù)，有的國內(nèi)廠家專門靠進(jìn)口母核及側(cè)鏈來發(fā)展β-內(nèi)酰胺抗生素，制備母核用的固定化酶也從國外進(jìn)口。

目前，國內(nèi)的青霉素鏈條的發(fā)展非常不均衡，雖然我國青霉素工業(yè)鹽有巨大的產(chǎn)能，但是合成中間體的技術(shù)還比較落后，在6APA、7-ADCA和GCLE三個(gè)中間體鏈條中，我國6APA技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，年產(chǎn)量在4000噸以上，能夠滿足國內(nèi)需求；7-ADCA的技術(shù)則相對(duì)落后，一直是國內(nèi)中間體發(fā)展的瓶頸，年產(chǎn)量約300噸左右。

第二節(jié) 產(chǎn)品工藝特點(diǎn)或流程

1、青霉素?；傅纳a(chǎn)方法

青霉素?；府a(chǎn)生菌菌種的改良

青霉素酰化酶產(chǎn)生菌菌種改良的任務(wù)是提高野生型菌種的產(chǎn)酶能力和酶活力，減少β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生以及弱化或消除不利于青霉素?；腹I(yè)化應(yīng)用的因素。通常對(duì)青霉素?；府a(chǎn)生菌進(jìn)行菌種改造的手段有誘變、定點(diǎn)突變和利用基因工程改良菌種。

DNA重組技術(shù)生產(chǎn)青霉素酸化酶

利用DNA重組技術(shù)將編碼青霉素酰化酶的基因轉(zhuǎn)移到合適的宿主菌中構(gòu)建高產(chǎn)和分泌型產(chǎn)生菌，可以彌補(bǔ)原產(chǎn)生菌的生產(chǎn)缺陷。若同時(shí)采用高

密度培養(yǎng)技術(shù)，還可以提高分泌產(chǎn)物青霉素酰化酶的比生產(chǎn)率和酶活力。

目前，國內(nèi)外關(guān)于PGA的基因工程 研究 大多基于大腸埃希氏菌的PGA基因（pga），還有一些關(guān)于巨大芽孢桿菌、糞產(chǎn)堿菌、嗜檸檬酸克呂沃爾

氏菌、香氏普羅威登斯菌PGA基因遺傳 分析 的報(bào)道。

不同來源的pga基因，其表達(dá)調(diào)控方式不同。大腸埃希氏菌PGA的基因調(diào)控是一個(gè)較為復(fù)雜的系統(tǒng)，PGA的表達(dá)是溫度敏感性。受細(xì)胞生長速

率的影響，且受葡萄糖阻遏和苯乙酸誘導(dǎo)。野生型大腸埃希氏菌PGA的表達(dá)受到包括轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、轉(zhuǎn)位和胞質(zhì)加工在內(nèi)的各步限制，不適合直接用于DNA重組，可以通過改變野生型大腸埃希氏菌pga基因的調(diào)節(jié)區(qū)域的某些堿基，同時(shí)增加核糖體結(jié)合位點(diǎn)與ATG啟動(dòng)密碼子之間的距離，來提高pga基因的表達(dá)量。大腸埃希氏菌胞質(zhì)PGA的分泌過程需要一定量的伴隨蛋白SECB參與PGA前體蛋白的穿膜輸送和蛋白質(zhì)折疊。伴隨蛋白的大量生成有助于胞質(zhì)PGA的積累。

不同的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)外源pga基因的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)產(chǎn)生一定的影響。在構(gòu)建重組PGA產(chǎn)生菌時(shí)較多選擇的是大腸埃希氏菌表達(dá)系統(tǒng)，其次是枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)和啤酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。此外，質(zhì)粒的拷貝數(shù)首先取決于自身的遺傳特性，同時(shí)還受到宿主菌生理狀況及生長環(huán)境的影響。

利用基因工程菌及發(fā)酵方法生產(chǎn)青霉素?；?/span>

工業(yè)化生產(chǎn)PGA主要采用大腸桿菌和巨大芽孢桿菌，雖然經(jīng)過復(fù)雜的誘變育種，仍存在產(chǎn)酶水平較低、變溫發(fā)酵和需要苯乙酸誘導(dǎo)等缺點(diǎn)。目前，國內(nèi)外 研究 者都在利用基因重組技術(shù)將PGA基因克隆并在大腸桿菌或芽孢桿菌中表達(dá)，以期大幅度提高PGA的產(chǎn)量和簡化生產(chǎn)工藝。

整體來說，青霉素?；傅纳a(chǎn)過程可以按照酶下面的流程：

青霉素?；傅纳a(chǎn)過程

大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)青霉素酰化酶

重組大腸桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分是酵母粉，其含量一般為3%。重組菌只需少量的供氧即能產(chǎn)生較高的青霉素?；富钚浴．?dāng)裝液量少時(shí)。

氧氣供應(yīng)充足，菌體生長速度快，對(duì)青霉素?；富钚员磉_(dá)不利。菌體在不同的生長階段，利用培養(yǎng)基中提供的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)產(chǎn)生有機(jī)酸或氨基氮。苯乙酸濃度隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸下降，苯乙酸在青霉紊酰化酶合成中具有誘導(dǎo)作用。維持或延長培養(yǎng)液中的最適苯乙酸濃度，可提高酶的活性和產(chǎn)量。

芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)青霉素酰化酶

與重組大腸桿菌系統(tǒng)相比，重組枯草桿菌系統(tǒng)具有較強(qiáng)的表達(dá)蛋白后加工能力，產(chǎn)物能夠分泌到胞外，從而有利于目標(biāo)蛋白的分離和純化。重組枯草桿菌生產(chǎn)PGA可以采用各種不同的表達(dá)系統(tǒng)，這些系統(tǒng)中，有些需要昂貴的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，有些則將PGA基因克隆到一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒中，由于質(zhì)粒的不穩(wěn)定性將影響PGA的表達(dá)。

巨大芽孢桿菌PGA在大腸桿菌中表達(dá)只能停留在細(xì)胞周質(zhì)空間，無法分泌到培養(yǎng)基中，不利于后續(xù)的分離，而且表達(dá)量也太低，沒有實(shí)用價(jià)值。

枯草桿菌則具有極強(qiáng)的分泌能力，加上它與巨大芽孢桿菌同屬革蘭氏陽性菌，PGA基因原來的SD序列也能在枯草桿菌中很好地起作用，表達(dá)的效果就好得多了。產(chǎn)青霉素G?；傅臏囟日T導(dǎo)型重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵條件的 研究 結(jié)果表明，最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)是細(xì)胞對(duì)數(shù)生長的中后期，誘導(dǎo)前應(yīng)將PH調(diào)節(jié)至中性；最佳誘導(dǎo)條件為升高溫度至50℃并維持4rain隨后將溫度降低到34℃進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)。在上述條件下，PGA的表達(dá)水平較高。SDS-PAGE電泳 分析 表明該重組菌能夠?qū)⒔^大部分表達(dá)的PGA分泌到細(xì)胞外，而且表達(dá)的PGA蛋白占有高比例（90%）。

重組青霉素G?；富蚬こ炭莶輻U菌株和巨大茅孢桿菌相比，具有表達(dá)量高，發(fā)酵條件簡單等優(yōu)點(diǎn)。

2、青霉素?；傅奶崛》椒?/span>

如何收純化青霉素酰化酶，尤其是使用大腸桿菌作為基因工程菌的時(shí)候。是個(gè)很關(guān)鍵的步驟。也是直接影響青霉素酰化酶質(zhì)量的一步。

聲破碎層析提取純化法

超聲破碎層析提取純化法超聲破碎層析提取純化所有純化步驟均在O-4℃左右操作，包括以下的一些基本步驟：無細(xì)胞提取液的制備、硫酸銨分段沉淀、DEAE-Sephadex A-50柱層析、DEAE-纖維素DE-52柱層析、Sephadex G-200凝膠過濾和羥基磷灰石柱層析。利用大腸桿菌作為基因工程菌，文獻(xiàn)報(bào)道多采用超聲波法提取，該法得到的粗酶液比活低，一般要經(jīng)過四、五步純化才能得到較高比活的酶液。

滲透壓沖擊法

滲透壓沖擊法提取青霉素酸化酶，得到的粗酶液比活高，只需經(jīng)過硫酸銨沉淀一步純化就能得到較高比活的酶液，且能直接用于固定化。大腸桿菌青霉素?；笇儆诎麅?nèi)酶，存在于細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞壁之間，大腸桿菌為細(xì)胞壁較脆弱的G菌，待提取的酶存在于周質(zhì)空間，將菌體置于高滲液中，使之被高滲液飽和，再將被飽和的菌體突然放入低滲介質(zhì)中，由于滲透壓的作用，細(xì)菌細(xì)胞壁被部分撐破，酶釋放到胞外。這樣就避免了全破碎細(xì)胞造成的內(nèi)容物過多釋放。比活過低的問題，同時(shí)提取過程在較低溫度下進(jìn)行，有效地保持了滲出酶的活力，提高了酶的比活，是超聲波法的10倍以上，因此只需硫酸銨沉淀、DEAE-cellulose-52柱層析就能得到聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示單帶的酶。滲透壓沖擊法提取青霉素酰化酶不需復(fù)雜的設(shè)備，宜放大，采用此法一次處理發(fā)酵液菌體，得到較好的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)證明，提取細(xì)胞壁較脆弱的G茵的胞內(nèi)酶，滲透壓沖擊法是一種快速得到高比活粗酶液的有效方法。

吸附劑法

純化發(fā)酵液中的青霉素?；?。方法采用吸附純化法。硅藻土經(jīng)氫氧化銨處理后可用于從發(fā)酵液中直接提取青霉素?；?。此法可在常溫下操作，酶活力收率較高，具有潛在的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。提取青霉素?；傅牡谝徊绞占w絲。菌體的收集主要是離心法，由于細(xì)菌細(xì)胞很小，難于沉降，離心法能耗很大。采用絮凝技術(shù)收集菌體簡單經(jīng)濟(jì)，但菌體收集不徹底。采用絮凝劑與離心相結(jié)合的方法，大大縮短離心時(shí)間，既不丟失菌體，又提高了單位時(shí)間內(nèi)處理發(fā)酵液的量，降低能耗，為青霉素?；腹I(yè)化生產(chǎn)提供了一定的依據(jù)。

中空纖維膜分離法

用傳統(tǒng)的硫銨法分離青霉素酰化酶不僅收率低，而且得到的濃縮酶液含有大量的硫酸銨，需要多次透析脫鹽才能用于制備固定化酶。超濾法是近年來酶制劑工業(yè)所采用的一種新的濃縮技術(shù)，雖然大大提高了酶的提取水平，但由于膜品種多，質(zhì)量不穩(wěn)定，孔徑分布廣等原因，影響了其推廣應(yīng)用。故選擇合適的超濾膜是此技術(shù)中決定其收率的一個(gè)關(guān)鍵部分。使用聚砜中空纖維超濾膜分離青霉素，操作時(shí)將青霉素酰化酶溶液注入儲(chǔ)槽中，在蠕動(dòng)泵提供的動(dòng)力下，溶液經(jīng)精濾后進(jìn)入超濾膜中，一方面溶液中的小分子物質(zhì)經(jīng)中空纖維的內(nèi)壁滲透出來成為超濾液而排出，另一方面溶液中的酶蛋白等大分子物質(zhì)得以保留并得到濃縮，返回到儲(chǔ)槽中。如此反復(fù)循環(huán)，直到達(dá)到規(guī)定的濃縮要求為止。超濾方法是一種物理變化的操作，不會(huì)引起物料的相變化，因此在操作過程中，酶的活性不會(huì)遭到破壞。且濃縮和提純可同時(shí)進(jìn)行，非常適用于大規(guī)模的連續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)。

新型的分離方法

用反膠束溶液提取大腸桿菌青霉素?；?/span>

青霉素?；阜e累在細(xì)胞的周質(zhì)空間內(nèi)。對(duì)于整體細(xì)胞破碎的缺點(diǎn)就在于酶會(huì)被細(xì)胞的其他物質(zhì)所污染。反膠束技術(shù)被用來提取分子量從6KD到

100KD的許多蛋白質(zhì)和酶，對(duì)他們活力的損害很小。經(jīng)過二-（2-乙基已基）硫代琥珀酸鈉（A（Ⅺ）穩(wěn)定的水一已烷粗乳狀液和細(xì)乳狀液可選擇性地改變大腸桿菌細(xì)胞通透性，用于提取青霉素?；?。就該酶的收率和純化比較了各種有機(jī)溶劑和表面活性劑的作用。酶的回收率比超聲波處理方法高，而且酶的比活較高。酶可以溶解在表面活性劑在極性有機(jī)溶劑中形成的反膠束的核心。

兩步色譜純化法

大腸桿菌超聲處理經(jīng)過過濾后使用兩步色譜純化法是一個(gè)有效的分離純化方法。獲取步驟第一步包括使用Cu2+作為金屬離子的固定金屬親和力色譜。該方法包含了兩步洗滌步驟：1MNH，a和0.01M瞇唑。酶活回收率可以達(dá)到90%以上。第二步是流水相互作用色譜。能夠回收酶活性的

77%。相比初始的酶粗提液，整個(gè)步驟可以純化酶66倍，回收酶活性的70%，在整個(gè)操作過程中無需外加步驟整個(gè)操作過程PH值基本保持在7左

右，是適合青霉素?；富钚詐H。

集成回收純化法

該法是直接從大腸桿菌組織勻漿或者粗提液里將非酶蛋白質(zhì)用四聚銨鹽沉淀，然后使用擬親和環(huán)境下用Amp-Seph吸附。添加四聚銨鹽對(duì)沉淀顆

粒的大小有直接影響。在室溫下往酶溶液里先后加入22%（w/v）的硫化銨和1%（w/v）的四聚銨鹽可以增加青霉素酰化酶的活性。在實(shí)驗(yàn)條件下，青霉素?；傅幕厥章蔬_(dá)到86%。這一集成體系可以同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞碎片和沉淀顆粒的過濾。將吸附在Amp—Seph上的青霉素?；赶疵撓聛?，活力較高，洗脫效率達(dá)95%。

第三節(jié) 國內(nèi)外技術(shù)未來發(fā)展趨勢(shì) 分析

青霉素?；笧榭赡婷?，一般在堿性條件下催化青霉素水解成為6-APA 母核和相應(yīng)的?；鶄?cè)鏈，而在酸性條件下可以催化6-APA 母核和?；鶄?cè)鏈的縮合反應(yīng)。近年來，青霉素?；傅陌l(fā)展主要是在以下2個(gè)方面：一是運(yùn)用基因工程的方法尋找該酶的高產(chǎn)菌株和性能優(yōu)良菌株；二是探索新的高效的固定化方法，提高酶活力和利用率，改善酶的特性。

青霉素酰化酶具有廣泛的市場應(yīng)用前景，青霉素?；敢延行У貞?yīng)用于半合成β內(nèi)酰胺抗生素的生產(chǎn)、肽的合成和外消旋混合物的拆分中。隨著酶技術(shù)的不斷發(fā)展，青霉素?；冈诠潭ɑ夹g(shù)、非水相介質(zhì)酶催化技術(shù)及定點(diǎn)突變技術(shù)等方面取得了一定的發(fā)展，而且 研究 者不斷采用基因工程方法篩選產(chǎn)青霉素?；傅母弋a(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌株。青霉素?；冈诨蚬こ毯兔腹こ谭矫娴牟粩喟l(fā)展，將使其在醫(yī)藥、食品、中間體合成等領(lǐng)域的應(yīng)用逐步擴(kuò)大。

目前，世界上抗菌藥的主力軍仍然是青霉素類和頭孢菌素類抗生素。新型的廣譜、長效、口服且無毒副作用的半合成青霉素類和頭孢菌素類抗生素被不斷地研制開發(fā)出來。在未來幾十年里，人類對(duì)制造這些半合成抗生素的重要中間體-6-APA需求會(huì)不斷增長，青霉素?；傅膽?yīng)用技術(shù)將越來越成熟。 研究 青霉素?；傅纳a(chǎn)和分離方法具有很重要的意義。隨著該酶的其他重要性質(zhì)被逐步開發(fā)出來，青霉素酰化酶將為人類做出更大的貢獻(xiàn)。


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