第一節(jié) 基本生產(chǎn)技術(shù)、工藝或流程

1985年具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)的發(fā)明,標(biāo)志著NAT的誕生。隨后,在PCR的基礎(chǔ)上,派生出許多其它原理的體外NAT方法。這些技術(shù)靈敏度和特異性或高或低,操作或簡(jiǎn)單或復(fù)雜,適合在各自不同的領(lǐng)域運(yùn)用，目前適用于大樣本量血液篩查并能滿足高靈敏度要求的擴(kuò)證擴(kuò)增技術(shù)主要為PCR技術(shù)和TMA技術(shù)。

1、PCR擴(kuò)增方法

PCR是一種體外模擬自然DNA復(fù)制過程的核酸擴(kuò)增技術(shù),以其高敏感性、高特異性和快速簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)得到了廣泛的應(yīng)用。通過簡(jiǎn)單的技術(shù)改進(jìn)和聯(lián)合,涌現(xiàn)出了各種各樣不同的PCR方法,如檢測(cè)RNA的逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT PCR)、敏感性和特異性均較高的巢式PCR (nested PCR)、可對(duì)靶序列進(jìn)行定量檢測(cè)的定量PCR、檢測(cè)基因超長(zhǎng)分布的多重PCR以及PCR結(jié)合酶標(biāo)技術(shù)(PCR ELISA)、PCR結(jié)合寡核酸探針雜交技術(shù)(PCR SSOP)、熒光PCR和免疫PCR等。

目前在臨床檢測(cè)中使用較多的是熒光定量PCR,主要用于各種傳染病的診斷、病毒滴度監(jiān)測(cè)以及療效評(píng)估,因采用熒光標(biāo)記的探針雜交或直接使用能和雙鏈DNA結(jié)合的熒光素檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,進(jìn)一步提高了檢測(cè)的敏感性和特異性。若加入已知濃度的內(nèi)標(biāo)或外標(biāo),便能進(jìn)行定量檢測(cè)。由于該方法實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)體系的全封閉和操作的全自動(dòng),不僅減少了污染,還提高了效率。

雖然國(guó)內(nèi)許多生物技術(shù)企業(yè)已經(jīng)利用熒光PCR方法開發(fā)出成熟的NAT定量檢測(cè)產(chǎn)品,如深圳匹基、廣州達(dá)安、上海復(fù)星、上?？迫A、上海浩源等,但這些產(chǎn)品均只獲得我國(guó)食品和藥品監(jiān)督部門的臨床診斷使用許可證。而臨床診斷和血液篩檢是2個(gè)不同的應(yīng)用領(lǐng)域, 血液篩檢對(duì)試劑的要求要比臨床診斷高很多。迄今為止正式通過美國(guó)FDA認(rèn)證可用于血液篩檢的試劑僅有2種,即Roche COBAS Ampli Screen HBV/HCV/HIV和 HIV 1/HCV檢測(cè)系統(tǒng),FDA評(píng)判這些試劑是否能用于血液篩檢的標(biāo)準(zhǔn)之一: 必須對(duì)50copies/ml的病毒核酸的檢出率>95%。相當(dāng)一部分國(guó)產(chǎn)熒光定量PCR檢測(cè)試劑或許能在某些標(biāo)本上獲得20copies/ml的靈敏度,但一般都很難滿足95%檢出低病毒載量標(biāo)本的要求。相信不斷提高檢測(cè)靈敏度,早日研發(fā)并注冊(cè)成功我國(guó)自己的NAT血液篩檢用試劑也是國(guó)內(nèi)生物技術(shù)企業(yè)的發(fā)展目標(biāo)。

2、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增方法 

包括轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增系統(tǒng)(transcription mediated amplification,TMA)和核酸序列依賴擴(kuò)增系統(tǒng)(nucleic acidｓsequence based amplification,　NASBA)。TMA是一種利用Money 鼠白血病病毒（MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA多聚酶2種酶的共同作用,在等溫條件下來擴(kuò)增RNA或DNA的反應(yīng)系統(tǒng),主要擴(kuò)增原理為: 目標(biāo)序列在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下,以引物為引導(dǎo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄, 逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性將雜合鏈上的RNA降解以后,合成雙鏈的DNA,并在T7 RNA多聚酶作用下,轉(zhuǎn)錄出成千上萬(wàn)個(gè)目標(biāo)RNA序列,這些RNA又可以作為模板進(jìn)行下一個(gè)循環(huán),整個(gè)反應(yīng)是一個(gè)自催化過程。NASBA的原理與TMA相似,只是在核酸提取和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的方法上有所不同。這兩種方法的特異性強(qiáng),靈敏度高,反應(yīng)條件簡(jiǎn)單,擴(kuò)增效率高,無(wú)需專門的擴(kuò)增儀器,且因整個(gè)反應(yīng)在1個(gè)試管中進(jìn)行,也減少了污染。

3、其它NAT技術(shù)

包括支鏈DNA檢測(cè)技術(shù)(branched DNA signal amplification assay,bDNA)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop mediated isothermal amplification,LAMP)、連接酶鏈技術(shù)(ligase chain reaction, LCR)和鏈置換擴(kuò)增(strand displacement amplification,SDA)等。這些技術(shù)或因?yàn)樽陨碓?或因?yàn)閯傃邪l(fā)出來尚未進(jìn)入臨床,均未在血液篩檢中應(yīng)用。如bDNA技術(shù)，在1995年左右推出,其信號(hào)放大是通過堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的探針雜交結(jié)合到一個(gè)樹枝狀核酸枝狀體上而實(shí)現(xiàn)的。bDNA技術(shù)對(duì)待測(cè)DNA無(wú)擴(kuò)增,特異性較好,能進(jìn)行病毒定量檢測(cè),動(dòng)態(tài)地揭示病毒滴度水平的變化,不僅在預(yù)測(cè)干擾素療效方面可為臨床提供更為有用的信息,還可作為丙肝病人對(duì)干擾素完全應(yīng)答的標(biāo)志反應(yīng)。但也正因?yàn)閎DNA技術(shù)沒有擴(kuò)增待測(cè)核酸,其檢測(cè)靈敏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于PCR,故該項(xiàng)技術(shù)實(shí)際上不適合用于血液篩檢,目前國(guó)內(nèi)主要將bDNA技術(shù)用于HBV或HCV病毒滴度的定量 分析 。

第二節(jié) 新技術(shù)研發(fā)、應(yīng)用情況

我國(guó)有關(guān)NAT血液篩檢 研究 的報(bào)道還比較少見。比較規(guī)范的血液篩檢 研究 更少，有的單位利用國(guó)產(chǎn)PCR試劑加電泳檢測(cè)的方法進(jìn)行檢測(cè)，其實(shí)驗(yàn)室交叉污染的問題很難控制。

國(guó)內(nèi)血液中心開展NAT檢測(cè) 研究 的情況

國(guó)內(nèi)原料漿開展NAT檢測(cè) 研究 情況

第三節(jié) 國(guó)外技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

NAT是一種新興的檢測(cè)方法,許多國(guó)家及輸血機(jī)構(gòu)都進(jìn)行了一系列的 研究 ,在國(guó)外特別是一些發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)已普遍應(yīng)用于血液篩檢[12]，例如,日本是世界上最早在全國(guó)范圍內(nèi)對(duì)血液進(jìn)行HBV、HCV、HIV NAT篩檢的國(guó)家[13],新加坡、中國(guó)香港也已經(jīng)分別采用不同的方式對(duì)血液進(jìn)行NAT篩檢; 德國(guó)和荷蘭從1997年起就開始NAT篩檢的嘗試,英國(guó)和法國(guó)的部分血站也從2000年起開始了NAT血液篩檢; 美國(guó)則從1999年3月開始在FDA新藥審核程序下使用不同的試劑進(jìn)行常規(guī)血液篩檢。

日本使用的方法為羅氏公司與日本紅十字會(huì)共同開發(fā)的全自動(dòng)的Ampli NATＴＭ NPX系統(tǒng)（為熒光PCR技術(shù)，可同時(shí)聯(lián)合檢測(cè)HBV,HCV和HIV），目前正在考慮使用Chiron公司的TMA技術(shù);美國(guó)ARC和新加坡使用的是Chiron公司的TMA技術(shù);美國(guó)血液中心(ABC)系統(tǒng)則使用羅氏COBAS Ampli Screen; 荷蘭及部分歐洲國(guó)家將荷蘭阿克蘇公司推出的 

Nucliesens全自動(dòng)核酸提取方法同羅氏的COBAS Ampli Screen擴(kuò)增體系結(jié)合起來使用;而英國(guó)和法國(guó)的部分血站在2000年采用的是Qiagen的全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)與羅氏的COBAS Ampli Screen擴(kuò)增體系結(jié)合起來的方法, 隨后部分血站又更換成Chiron的TMA技術(shù)。各血站根據(jù)自身特色, 正在對(duì)各種不同的技術(shù)組合進(jìn)行評(píng)估, 目的是尋求一種最適合的NAT技術(shù),既保障血液安全,又能保證血液的及時(shí)供給,還要做到省時(shí)省力。

第四節(jié) 技術(shù)開發(fā)熱點(diǎn)、難點(diǎn) 分析

核酸擴(kuò)增技術(shù)以其敏感、特異、快速、簡(jiǎn)便向人們充分展示了其在結(jié)核病臨床診斷中的巨大優(yōu)越性。Amplicor PCR和AMTDT已在國(guó)外臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室普遍開展應(yīng)用，并取得了令人滿意的效果。由PCR衍生的幾種新的分子診斷技術(shù)(LCR、SDA、QB復(fù)制酶擴(kuò)增法等)正逐步由實(shí)驗(yàn)室過渡到臨床。核酸擴(kuò)增技術(shù)是一種新興的發(fā)展中的診斷技術(shù)，在不少方面仍有待改進(jìn)與完善，如方法學(xué)上進(jìn)一步自動(dòng)化、簡(jiǎn)單化，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件與參數(shù)，不斷改進(jìn)檢測(cè)手段，拓寬應(yīng)用范圍(分支桿菌菌型鑒定、藥敏試驗(yàn)、化療效果的監(jiān)測(cè)等)，開發(fā)更為實(shí)用的標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒等。隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，相信該技術(shù)不久將成為診斷結(jié)核病的常規(guī)方法。

第五節(jié) 技術(shù)未來發(fā)展趨勢(shì) 分析

最近幾年,NAT血液檢測(cè)篩選系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于全球范圍內(nèi)血庫(kù)及輸血中心的血液樣本中的病毒檢測(cè)。許多國(guó)家（地區(qū)）現(xiàn)在僅使用經(jīng)NAT測(cè)試顯示HCV RNA為陰性的血液用于病人輸血。在另一些國(guó)家（地區(qū)）,還要求針對(duì)其它病毒的測(cè)試(即HIV, HBV, parvovirus B19,HAV)。當(dāng)前的NAT測(cè)試系統(tǒng)通常用于測(cè)試來自16~96位供血者的集體血樣。當(dāng)前,機(jī)構(gòu)內(nèi)部自我改進(jìn)的NAT系統(tǒng)被廣泛使用,因?yàn)樗鼈兙哂斜壬虡I(yè)系統(tǒng)更了不起的敏感性、靈活性、高通量及低成本。結(jié)合自動(dòng)化的核酸提取系統(tǒng),譬如NucliSens 或BioRobot, 結(jié)合自動(dòng)化的擴(kuò)增及檢測(cè)系統(tǒng),譬如COBAS Amplicor, AmpliScreen 或TaqMan 檢驗(yàn),數(shù)個(gè)國(guó)家（地區(qū)）血液服務(wù)中心開發(fā)了完全自動(dòng)化的NAT系統(tǒng)。隨著NAT 技術(shù)進(jìn)展，在將來有可能實(shí)現(xiàn)由集體血樣NAT向單個(gè)血樣NAT的轉(zhuǎn)變，以及整合多種病毒或包括寄生蟲和細(xì)菌的其它病原體的檢測(cè)?；蛟S更為重要的意義在于,利用已有的NAT技術(shù)定期進(jìn)行血庫(kù)審查，可以迅速引入對(duì)將來可能出現(xiàn)的新型病原體的篩選檢測(cè)，從而防止類似二十年前發(fā)生的由輸血導(dǎo)致的HIV傳染。


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