第一節(jié) 熒光PCR檢測試劑盒的簡介

一、熒光PCR檢測試劑盒的概念與性質(zhì)

1、概念

熒光PCR檢測試劑盒采用聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）技術(shù)檢測，可用于檢測各種待檢標本(如血液、糞便、食物、生物材料等)中所感染的特定細菌或病毒的某一特定基因，進而確定該細菌或病毒的感染/污染狀態(tài)。熒光PCR檢測試劑盒中所含引物能特異性擴增該細菌或者病毒的保守區(qū)域，不會交叉擴增細胞基因組。與傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)檢測方法和免疫血清學(xué)檢測方法相比較，熒光PCR檢測試劑盒檢測方法更為快速，特異性更高。

2、性質(zhì)

特異性；靈敏性；定量準確性（標準品）；穩(wěn)定性；擴增效率：看曲線的斜率；熒光值：有效線性范圍：103-109/mL；精密性。

擴增曲線

二、熒光PCR檢測試劑盒在不同領(lǐng)域的用途

熒光PCR檢測試劑盒，供體外檢測使用。通過檢測可以確認各種待檢標本(如血液、糞便、食物、生物材料等)否感染或污染特定細菌或者病毒。

1、家畜傳染病學(xué)和獸醫(yī)衛(wèi)生檢疫學(xué)領(lǐng)域

組根據(jù)國內(nèi)外重大動物疫病快速診斷與檢測需求，針對口蹄疫、新城疫、禽流感、豬鏈球菌病、狂犬病、動物源戊型肝炎、高致病性豬藍耳病、H3N8亞型馬流感、鯉春病以及魚傳染性造血器官壞死病10種重大動物疫病，經(jīng)大量基因序列數(shù)據(jù) 分析 ，引物探針設(shè)計，篩選優(yōu)化，敏感性特異性等試驗，在國內(nèi)外率先建立了檢測上述重大動物疫病的靈敏、特異、快速的18項實時熒光PCR檢測技術(shù)。根據(jù)研發(fā)的檢測技術(shù)，研制出18種熒光PCR配套檢測試劑盒，建立生產(chǎn)質(zhì)控標準，在重大疫病防控工作中發(fā)揮重要作用。

2、血液分子生物學(xué)檢驗

目前，熒光PCR檢測試劑盒技術(shù)在血液學(xué)檢驗領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，如應(yīng)用于血液病基因 分析 、基因診斷、白血病分型、指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后和微小留病檢測等方面。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進一步發(fā)展，血液病的基因表達和治療、細胞之間和細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)、特異的血液病基因或融合基因的檢測及應(yīng)用將成為當代血液分子生物學(xué)檢驗的主要內(nèi)容和方向。

三、熒光PCR檢測試劑盒工業(yè)的發(fā)展簡史

隨著人類基因組計劃的完成，后基因時代已經(jīng)到來，未來必然是基因診斷代替目前醫(yī)療機構(gòu)采用的培養(yǎng)法和免疫血清學(xué)方法通過檢測DNA可以快速高效的診斷疾病。

隨著生物技術(shù)和生命科學(xué)的發(fā)展，21世紀將是生物技術(shù)的世紀。作為生物技術(shù)發(fā)展的產(chǎn)物，診斷試劑也在不斷隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展不斷拓寬其種類。雖然目前診斷試劑僅占生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的25%，然而卻對當前的醫(yī)療診斷產(chǎn)生了很大的沖擊。由于遺傳工程、基因重組以及單株抗體等生物技術(shù)不斷應(yīng)用于開發(fā)診斷試劑，因而除了增加試劑的敏感度及特異性外，也使得過去不可能或曠日費時的傳染病、腫瘤或基因異常等診斷，成為可能或快速的診斷。此外，與自動化 分析 儀器或電子技術(shù)的結(jié)合，更使這些精確的診斷不僅由 研究 階段進入了臨床例行診斷階段，而且縮短了醫(yī)療與診斷之間的距離。

臨床診斷試劑最初主要是由醫(yī)學(xué)實驗室或檢驗操作人員自己配置，試劑種類少，應(yīng)用面窄；隨后一些生產(chǎn)化學(xué)試劑和藥品、醫(yī)療儀器廠家的加入，形成了初期的診斷試劑產(chǎn)業(yè)。在過去20年，隨著科技的發(fā)展，尤其現(xiàn)代生物技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)、微電子處理器、光化學(xué)等方面的重要發(fā)現(xiàn)和進展，診斷試劑先后經(jīng)歷了化學(xué)、酶、免疫測定和探針技術(shù)4次技術(shù)革命，每一次革命都使臨床診斷試劑的技術(shù)跨上了一個新臺階。不僅靈敏度、特異性有了極大地提高，而且應(yīng)用范圍迅速擴大，操作門檻逐步降低，同時也使得臨床診斷試劑的商業(yè)價值日趨重要，現(xiàn)在臨床診斷度劑已發(fā)展成為一個擁有200億美元國際市場，年增長達到3%～5%的朝陽產(chǎn)業(yè)，在疾病預(yù)防、療效和愈后的判斷、治療藥物的監(jiān)測、健康狀況的評價以及遺傳性預(yù)測等領(lǐng)域，正發(fā)揮著越來越大的作用。

目前國內(nèi)臨床診斷試劑市場規(guī)模已經(jīng)發(fā)展到每年30億～40億元人民幣的銷售額，其中臨床生化占30%，免疫產(chǎn)品25%，血液產(chǎn)品8%～10%，尿液 分析 產(chǎn)品3%～5%，微生物產(chǎn)品2%～3%。未來5年，國內(nèi)臨床診斷市場的年增長率高達15%～20%。由于國內(nèi)市場起步晚，產(chǎn)業(yè)化發(fā)展長期滯后，所以同國外公司相比，國內(nèi)的企業(yè)普遍規(guī)模小、品種少，發(fā)展不均衡，國內(nèi)企業(yè)年銷售額超過或接近1億的診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)寥寥無機，銷售額超過5000萬元人民幣的不超過10家。同時由于惡性競爭的結(jié)果，各企業(yè)的平均贏利水平都大幅度下降，從最初的40%～50%，下降到目前的10%～20%。國內(nèi)診斷試劑前10家的生產(chǎn)廠家的銷售額市場占有率為20%左右。大型生產(chǎn)廠家以獨資、合資為主。許多企業(yè)的股份制改造已經(jīng)完成，一些企業(yè)正在尋求上市。

目前，中國診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)正處于發(fā)展的關(guān)鍵時期，隨著人們對診斷試劑在預(yù)防與治療疾病過程中重要性認識的增加、市場規(guī)模的不斷擴大以及國家日益加強的對產(chǎn)品生產(chǎn)廠家的嚴格管理，中國臨床診斷試劑產(chǎn)業(yè)已經(jīng)有了一個日趨良好的發(fā) 展環(huán)境。同時臨床檢驗 市場發(fā)展 速度的減緩，使得各主要廠商在致力于尋找新的更大的市場機會外，也更加注重企業(yè)整體水平的競爭，這都無疑有利于產(chǎn)業(yè)的發(fā)展壯大。

第二節(jié) 熒光PCR檢測試劑盒的技術(shù)現(xiàn)狀

一、熒光PCR檢測試劑盒的技術(shù)現(xiàn)狀簡述

熒光PCR檢測試劑盒檢測原理是由一對引物介導(dǎo)，能在動植物體外對特定基因(DNA)片斷進行快速酶促擴增，經(jīng)過n個熱循環(huán)擴增，擴增產(chǎn)物中所含特定基因數(shù)是原始模板數(shù)的(1+E)n(0＜E＜1,擴增效率＝倍，使得檢測擴增產(chǎn)物中的特定基因成為可能。

聚合酶鏈式反應(yīng)自從1993年到現(xiàn)在很快經(jīng)歷了四代產(chǎn)品：

第一代：手動/機械手式水浴基因擴增 

用三個恒溫水浴箱，分別將三個水浴溫度恒定在三個溫度：PCR的高溫變性溫度（如94℃）低溫復(fù)性溫度（如58℃），適溫延伸溫度（如72℃）。再用一個裝有PCR標本試管的提籃，用手工在不同溫度的水浴箱中依次水浴，標本在每個水浴箱中恒溫的時間用秒表計時。這樣PCR標本就能完成下述形式的熱循環(huán)：94℃ 30S       58℃ 45S       72℃  60S          40次循環(huán)

這種方法的特點是：實驗人員勞動強度大，容易因疲勞引起差錯；而優(yōu)點是:設(shè)備簡單，投資少，與自動化基因擴增儀相比，它無須升降溫過程，實驗時間短，試驗更接近理想PCR反應(yīng)條件，事實表明實驗效果還是不錯的，但由于標本試管從一個水浴箱往另一個水浴箱移動中要較短暫暴露于空氣中，因此如移動速度不夠快時也會對標本形成溫度干擾，影響結(jié)果。本方法的另外一些缺點包括只能局限三個溫階（某些PCR反應(yīng)需要多于三個溫階）、液體污染以及在低氣壓地區(qū)水溫難以燒到94℃變性溫度等。

為改進提高本方法的自動化水平，有人設(shè)計了機械手裝置，替代上述手工移動標本過程，形成了機械手水浴式基因擴增儀，該改進解決了實驗人員的高強度勞動問題，但又帶來了一個機械手部件大行程頻繁相對運動而引起的高故障。這種類型的基因擴增儀在九十年代中期我國北京、上海有定型的產(chǎn)品銷售，應(yīng)用也較廣，曾為我國的分子生物學(xué)的發(fā)展做出過積極貢獻，而后便逐步被自動化程度更高的擴增儀替代，現(xiàn)在很少有單位使用。 

第二代：自動化控制型定性基因擴增儀

與上述水浴式擴增儀相比，也有人稱該種擴增儀為干式基因擴增儀，它是最具代表性的擴增儀，包括后續(xù)介紹的第三代、第四代都是以第二代為基礎(chǔ)集成了定量檢測部分。

第三代：終點定量/半定量

第二代的定性PCR只能判斷陰性陽性，而無法評價特定核酸的濃度及定量 分析 ，定量PCR至少能達到定性PCR無法實現(xiàn)的下列功能：潛伏期病毒濃度探測；感染程度；致病病原體數(shù)量變化測定；抗病毒藥物療效評估；恢復(fù)期病毒載量檢測

自從1996年美國ABI公司發(fā)明第一臺熒光定量PCR儀以來，PCR技術(shù)和應(yīng)用從定性向定量快速發(fā)展.終點定量PCR的優(yōu)點是設(shè)備投資少，對于國內(nèi)經(jīng)濟條件還不能購買昂貴實時熒光定量PCR儀的科研單位和醫(yī)療機構(gòu)，利用現(xiàn)有的第二代常規(guī)定性PCR儀，在添加一臺專用的單孔PCR終點產(chǎn)物熒光定量檢測儀便可開始工作，起到定量的作用。終點定量PCR技術(shù)是從定性向?qū)崟r定量過渡的一個中間產(chǎn)品，而PCR終點產(chǎn)物熒光定量儀進口產(chǎn)品較少，國產(chǎn)儀器較多，如西安天隆的TL988，上海棱光的DA620型等 

第四代：實時定量PCR

實時定量QPCR儀＋實時熒光定量試劑+通用電腦+自動 分析 軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實時熒光定量檢測系統(tǒng)。

二、熒光PCR檢測試劑盒技術(shù)流程

基本原理：通過大量對比某一種細菌或病毒的基因，得到該細菌或病毒共同保守序列，根據(jù)該序列設(shè)計特異性引物，通過PCR擴增，即可獲得相應(yīng)大小的片段，以此來檢測該細菌或者病毒的感染/污染狀態(tài)。

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