第一節(jié) 產(chǎn)品技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

L-肉堿的體外生產(chǎn)包括提取法、合成法、微生物發(fā)酵法與酶轉(zhuǎn)化法4種。其中酶轉(zhuǎn)化法又可分為DL肉堿衍生物的酶法拆分、β-脫氫肉堿的酶法轉(zhuǎn)化、反式巴豆堿的酶法水解與γ-丁酰甜菜堿的酶法羥化4種。

制備方法評(píng)價(jià) 分析 ：

1、直接提取法得到的左旋肉堿的絕對(duì)量少，并且因有結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的存在而難以分離，提取純化較繁鎖，得率低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)性不合理。

2、生物合成法嚴(yán)格限制在肝、腎組織，還需煙酸、維生素C、維生素B6、Fe2+的參與，其中維生素C對(duì)肉堿的合成速度影響最大。合成-分子賴(lài)氨酸和三分子蛋氨酸，賴(lài)氨酸提供碳鏈和氮原子，蛋氨酸提供甲基。肌肉組織中肉堿含量雖然高，但要依賴(lài)來(lái)自肝、腎的血液輸送。

3、工業(yè)上常采用以還氧氯丙烷為起始原料的化學(xué)合成法，可在反應(yīng)的不同步驟中進(jìn)行化學(xué)拆分或反應(yīng)前加人手性試劑進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)誘導(dǎo)得到左旋肉堿。該法簡(jiǎn)便，原料廉價(jià)，收率較好，但必須解決NaCN等造成的污染。

4、化學(xué)拆分法避開(kāi)了有毒的氰化物和氯化汞，且無(wú)需離子交換樹(shù)脂，操作安全，簡(jiǎn)便;生物拆分法盡管純度很高，但得率太低;通過(guò)消旋處理得到的右旋肉堿在以前是作為廢物處理的經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)得到左旋肉堿，這對(duì)于廢物利用、降低成本以及環(huán)境保護(hù)都有很重要的意義。

5、微生物發(fā)酵法生產(chǎn)肉堿水平較低，如液體發(fā)酵法一般含肉堿0.3~0.4mg/g干菌體。另外，由于菌種篩選較復(fù)雜，許多 研究 仍停留在實(shí)驗(yàn)室水平。

6、從脫氫肉堿出發(fā)的肉堿衍生物轉(zhuǎn)變法必須利用昂貴的輔酶NADH，只適于實(shí)驗(yàn)室操作從巴豆甜菜堿出發(fā)的肉堿衍生物轉(zhuǎn)變法利用拆分廢物作原料，降低了成本，潛力較大;從γ-丁基甜菜堿出發(fā)的肉堿衍生物轉(zhuǎn)變法盡管轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量都很高，但由于成本昂貴限制了工業(yè)化的生產(chǎn)規(guī)模。

7、通過(guò)基因重組技術(shù)生產(chǎn)左旋肉堿尚處于試驗(yàn)階段，由于此法潛在的優(yōu)越性，將是今后的 研究 熱點(diǎn)。

第二節(jié) 產(chǎn)品工藝特點(diǎn)或流程

一、肉堿在體內(nèi)的合成過(guò)程

L-Lys和L-Met在體內(nèi)合成L-肉堿最初是在20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)的。從此 研究 者們揭示了這種氨基酸衍生物在動(dòng)物健康和疾病中起著極其重要的作用（Tanphaichitr等,1971）。肝臟和腎臟是合成L-肉堿的主要合成部位，只有肝臟、腎臟和大腦包含全部過(guò)程所需要的酶。L-肉堿是由Lys、Met、三種維生素（煙酸、抗壞血酸、VB6）、二價(jià)鐵離子和酶的參與下合成的，Lys提供C架（HorneandBroquist,1973;Tanphaichitr等,1973），4個(gè)N甲基則來(lái)自于Met（Tanphaichitr等,1971），Lys和Met之比為1：3.合成過(guò)程見(jiàn)下圖。合成后可直接被組織細(xì)胞吸收利用或轉(zhuǎn)供給其它組織細(xì)胞。

L-肉堿的合成路徑

二、制備方法

1、直接提取法

早期的左旋肉堿是從肉浸膏中分離出來(lái)的，典型的方法是Carter等1952年用4508牛肉浸膏提取0.6g純晶肉堿。近年仍有關(guān)于從牛肉或牛乳處理液中提取左旋肉堿的專(zhuān)利報(bào)道。

2、生物合成法

L-肉堿的生物合成始于賴(lài)氨酸和蛋氨酸。首先是富含賴(lài)氨酸的蛋白質(zhì)在蛋白質(zhì)甲基化酶的催化下，由ti-腺昔蛋氨酸供給甲基將多膚鏈中的賴(lài)氨酸轉(zhuǎn)化為E一三甲基賴(lài)氨酸，隨后通過(guò)體內(nèi)蛋白酶水解生成三甲基賴(lài)氨酸，再通過(guò)四步酶促反應(yīng)合成L-肉堿。

3、化學(xué)合成法

1）以環(huán)氧氯丙烷為起始原料

2）以氯乙酞乙酸乙醋為起始原料

3）以甘露糖醇為起始原料

4、消旋體拆分法

化學(xué)合成消旋肉堿雖已完全工業(yè)化，但由于不能將L-型和有負(fù)作用的D-型分開(kāi)，一般禁止使用。如果將消旋肉堿(DL-肉堿)乙酞化再光學(xué)拆分，可得到較高光學(xué)純度的左旋肉堿。

1）化學(xué)拆分

美國(guó)專(zhuān)利3151149使用D-(+)一樟腦-10-磺酸對(duì)DL-肉堿進(jìn)行拆分，但要使用AgN03除去(Ag+C1-，成本高，收率低(<50%)，純度低存在)，生產(chǎn)條件苛刻(A邪I見(jiàn)光使容器變黑)。李全等人 研究 了左旋肉堿鹽酸鹽的新合成法，以氯乙酸乙醋為原料，經(jīng)格氏反應(yīng)、還原、錢(qián)化、水解及拆分反應(yīng)，合成了產(chǎn)物(3302.

2）生物拆分

利用微生物專(zhuān)一降解右旋肉堿的能力生產(chǎn)左旋肉堿。Charles多次試驗(yàn)選育出降解右旋肉堿有特效的菌株，經(jīng)259C,44h的培養(yǎng)，右旋肉堿全部消失，左旋肉堿剩下38%03。

3）酶法拆分

將DL-肉堿酞化，制成酞胺、乙酞肉堿等再篩選動(dòng)物微生物中存在的醋酶、酞胺酶等進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。中山清等報(bào)道用假單抱菌的酞胺酶光學(xué)拆分DL-構(gòu)型的消旋肉堿，以制備得到光學(xué)純度為99%的左旋肉堿。

4）右旋肉堿的再利用

消旋所得的右旋肉堿以前是作廢物處理的Giannessi從右旋肉堿出發(fā)，經(jīng)酞化、酸水解、內(nèi)醋化、水解，再通過(guò)離子交換柱，加上McS02C1然后在NatC03水溶液中攪拌可得到左旋肉堿。

5、微生物發(fā)酵法

細(xì)菌、放線(xiàn)菌、酵母菌和霉菌等許多微生物中都有能水解合成L-肉堿的菌株。利用液體深層培養(yǎng)或固體發(fā)酵，篩選優(yōu)良菌株，可生產(chǎn)左旋肉堿。瑞士龍沙公司已將微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)左旋肉堿酒石酸。

6、肉堿衍生化法

1）從脫氫肉堿出發(fā)

在由40單位的肉堿脫氫酶、NAD;2mM、甲酸脫氫酶40單位、HC02NH4150mM,磷酸50mM(pH7.5),氯霉素6mg/50mL組成的混合液中勻速加人脫氫肉堿鹽酸鹽0.8M、甲酸0.8M。加完后，調(diào)節(jié)溫度至3090，加人2MNHo0H，調(diào)pH7.0。經(jīng)過(guò)70h，獲得10.3g左旋肉堿，收率96%。

2）從巴豆甜菜堿出發(fā)

巴豆甜菜堿是生物合成L-肉堿的前體。江蘇省微生物 研究 所用此法酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)L-肉堿5g/L，轉(zhuǎn)化率40%。

7、基因重組技術(shù)法

在傳統(tǒng)發(fā)酵基礎(chǔ)上，通過(guò)基因重組技術(shù)得到高轉(zhuǎn)化率的微生物菌株，生產(chǎn)左旋肉堿。1995年Eichler將大腸桿菌中CaiD.CaiE基因克隆，并獲得轉(zhuǎn)基因工程菌E.colik38，使其肉堿消旋酶的含量及活性顯著提高，可用于將DL一肉堿轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)一肉堿。

三、主要裝置

工業(yè)上常采用以還氧氯丙烷為起始原料的化學(xué)合成法，可在反應(yīng)的不同步驟中進(jìn)行化學(xué)拆分或反應(yīng)前加人手性試劑進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)誘導(dǎo)得到左旋肉堿。該法簡(jiǎn)便，原料廉價(jià)，收率較好，但必須解決NaCN等造成的污染。

左旋肉堿生產(chǎn)設(shè)備

四、制備方法評(píng)價(jià)

(1)直接提取法得到的左旋肉堿的絕對(duì)量少，并且因有結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的存在而難以分離。提取純化較繁鎖，得率低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)性不合理。

(2)生物合成法嚴(yán)格限制在肝、腎組織，還需煙酸、維生素C、維生素B6、Fe2+的參與，其中維生素C對(duì)肉堿的合成速度影響最大。合成一分子賴(lài)氨酸和三分子蛋氨酸，賴(lài)氨酸提供碳鏈和氮原子，蛋氨酸提供甲型。肌肉組織中肉堿含量雖然高，但要依賴(lài)來(lái)自肝、腎的血液輸送。

(3)工業(yè)上常采用以還氧氯丙烷為起始原料的化學(xué)合成法，可在反應(yīng)的不同步驟中進(jìn)行化學(xué)拆分或反應(yīng)前加人手性試劑進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)誘導(dǎo)得到左旋肉堿。該法簡(jiǎn)便，原料廉價(jià)，收率較好，但必須解決NaCN等造成的污染。

(4)化學(xué)拆分法避開(kāi)了有毒的氰化物和氯化汞，且無(wú)需離子交換樹(shù)脂，操作安全，簡(jiǎn)便；生物拆分法盡管純度很高，但得率太低；通過(guò)消旋處理得到的右旋肉堿在以前是作為廢物處理的，經(jīng)過(guò)一系列反應(yīng)得到左旋肉堿，這對(duì)于廢物利用、降低成本以及環(huán)境保護(hù)都有很重要的意義。

(5)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)肉堿水平較低，如液體發(fā)酵法一般含肉堿0．3～0．4mg／g干菌體。另外，由于菌種篩選較復(fù)雜，許多 研究 仍停留在實(shí)驗(yàn)室水平。

(6)從脫氫肉堿出發(fā)的肉堿衍生物轉(zhuǎn)變法必須利用昂貴的輔酶NADH，只適于實(shí)驗(yàn)室操作；從巴豆甜菜堿出發(fā)的肉堿衍生物轉(zhuǎn)變法利用拆分廢物作原料，降低了成本，潛力較大；從^r一丁基甜菜堿出發(fā)的肉堿衍生物轉(zhuǎn)變法盡管轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量都很高，但由于成本昂貴限制了工業(yè)化的生產(chǎn)規(guī)模。

(7)通過(guò)基因重組技術(shù)生產(chǎn)左旋肉堿尚處于試驗(yàn)階段，由于此法潛在的優(yōu)越性，將是今后的 研究 熱點(diǎn)。

第三節(jié) 國(guó)內(nèi)外技術(shù)未來(lái)發(fā)展趨勢(shì) 分析

1、繼續(xù)加強(qiáng)產(chǎn)品工藝整合、開(kāi)發(fā)

從目前國(guó)內(nèi)外左旋肉堿產(chǎn)品生產(chǎn)工藝來(lái)看，目前所應(yīng)用的工藝在工藝條件、生產(chǎn)規(guī)模等方面還不盡如意。因此未來(lái)， 行業(yè) 必須進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)品工藝的整合、開(kāi)發(fā)。從目前 行業(yè) 主要 研究 方向來(lái)看，化學(xué)合成法、化學(xué)拆分法以及基因重組法有望在未來(lái)得到進(jìn)一步的技術(shù)發(fā)展。

2、產(chǎn)品純度進(jìn)一步提高

左旋肉堿工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)品往往含有一定量的右旋肉堿，右旋肉堿不僅沒(méi)有減肥作用，而且對(duì)肌肉生成有害，可造成肌力、肌萎縮。這也是造成目前左旋肉堿不能大規(guī)模生產(chǎn)的原因。在未來(lái)產(chǎn)品技術(shù) 研究 過(guò)程中，加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)品生產(chǎn)環(huán)節(jié)的生成物控制，提高產(chǎn)品純度也是未來(lái) 行業(yè) 技術(shù) 研究 的重點(diǎn)。

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