第一節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器基本生產(chǎn)技術(shù)、工藝或流程

動物細(xì)胞發(fā)酵罐是實(shí)現(xiàn)動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的樞紐與核心設(shè)備，為細(xì)胞生長提供相宜的環(huán)境，關(guān)系到細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量和產(chǎn)量，因而在動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù) 研究 中據(jù)有舉足輕重的地位，對于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)規(guī)?；咝С霎a(chǎn)具有重大意義。根據(jù)動物細(xì)胞的培養(yǎng)特性，具務(wù)低的剪切，較好的傳遞效果和液體力學(xué)性質(zhì)是這類發(fā)酵罐設(shè)計(jì)或改進(jìn)所必需遵循的原則。

兩種重要的動物細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵罐：

1、攪拌式發(fā)酵罐

攪拌式發(fā)酵罐靠攪拌漿提供相攪拌的動力，它有較大操縱范圍、良好的混合性和濃度平均性，因此在生物反應(yīng)中被廣泛應(yīng)用。動物細(xì)胞培養(yǎng)中的攪拌式發(fā)酵罐都是經(jīng)由改進(jìn)的，包括改進(jìn)供氧方式、攪拌漿的形式及在發(fā)酵罐內(nèi)加裝輔件等。各種動物細(xì)胞培養(yǎng)攪拌式發(fā)酵罐的主要區(qū)別在于攪拌器的結(jié)構(gòu)。這些攪拌器外形主要有棒形、氣槳葉形、圓筒形，攪拌方式主要有表面攪拌、深層攪拌、氣流攪拌；動力來源為磁力或是電念頭驅(qū)動。

2、氣升式發(fā)酵罐

氣升式發(fā)酵罐也是實(shí)現(xiàn)動物細(xì)胞高密度培養(yǎng)的常用設(shè)備之一，尤其合用于培養(yǎng)切變敏感的細(xì)胞。氣升式發(fā)酵罐與攪拌式發(fā)酵罐比擬，產(chǎn)生的湍動溫順而平均，剪切力相稱小，器內(nèi)沒有機(jī)械運(yùn)動部件，因而細(xì)胞操縱率比較低；直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高；液體輪回量大，使細(xì)胞和營養(yǎng)成分能平均分布于培養(yǎng)基中。

第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器新技術(shù)研發(fā)、應(yīng)用情況

細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器可簡單地分為機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器、氣升式生物反應(yīng)器、中空纖維生物反應(yīng)器以及拋棄式的一次性生物反應(yīng)器等。目前，超過70％的動物細(xì)胞反應(yīng)器是機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器，而且細(xì)胞培養(yǎng)的最大規(guī)模已經(jīng)放大到25000升。機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器主要由罐體、電機(jī)和電子控制器等部分組成。實(shí)驗(yàn)室 研究 用的臺式反應(yīng)器（Bench bioreactor），罐體一般是玻璃的，疫苗或者抗體等工業(yè)化應(yīng)用的罐體則由是不銹鋼制造的。攪拌由頂端或底部的電機(jī)來驅(qū)動，能獲得良好的混合和傳質(zhì)效果。罐體頂端或側(cè)面的在線傳感器，連接著控制器，可以連續(xù)測定罐體培養(yǎng)液的溫度、pH值、溶氧（dissolve oxygen，DO）等參數(shù)，并通過計(jì)算機(jī)程序?qū)崿F(xiàn)在線檢測和控制。對于幾升的玻璃罐，可以用高壓鍋滅菌；對于幾十升、上百升及上千升以上的不銹鋼罐，一般采用在線清洗（clean in place,CIP）和原位滅菌(sterilization in place, SIP)裝置實(shí)現(xiàn)反應(yīng)器的清洗和滅菌。攪拌式生物反應(yīng)器的主要優(yōu)點(diǎn)是，結(jié)構(gòu)相對簡單，既可用于懸浮培養(yǎng)，也適用于微載體培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)工藝放大相對容易，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，非常適合于工廠化生產(chǎn)生物制品。但其機(jī)械攪拌會產(chǎn)生一定剪切力，可能對細(xì)胞造成的損傷，不過在實(shí)踐應(yīng)用中可通過改變攪拌槳葉形狀、細(xì)胞培養(yǎng)基的改進(jìn)等措施來解決。此外，動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的大型化、自動化和精巧化也成為大家關(guān)注的問題。

2008年起，北京天和瑞生物科技有限公司連續(xù)推出CLAVORUSTM120L、CLAVORUSTM 650L、CLAVORUSTM1200L動物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器，并在疫苗 行業(yè) 得到了成功應(yīng)用，從而打破了我國動物細(xì)胞反應(yīng)器完全依賴進(jìn)口的局面，促進(jìn)了我國疫苗等生物制藥 行業(yè) 的技術(shù)升級。國產(chǎn)動物細(xì)胞反應(yīng)器相比于進(jìn)口反應(yīng)器，無論從反應(yīng)器質(zhì)量控制、反應(yīng)器配件提供、反應(yīng)器供貨速度等方面，還是在反應(yīng)器工藝技術(shù)支持等方面，都有顯著的優(yōu)勢，并從細(xì)胞培養(yǎng)工藝放大上解決了我國生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化種最薄弱的技術(shù)環(huán)節(jié)——動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的裝備技術(shù)支撐問題,有利地推進(jìn)了我國疫苗生產(chǎn)企業(yè)從大規(guī)模轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)動物細(xì)胞疫苗工藝技術(shù)向生物反應(yīng)器培養(yǎng)動物細(xì)胞疫苗工藝技術(shù)的轉(zhuǎn)變。而這種疫苗工藝技術(shù)的轉(zhuǎn)變，合乎世界生物制藥發(fā)展趨勢，也表明我國疫苗等生產(chǎn)技術(shù)正逐步與世界生物制藥技術(shù)發(fā)展主流接軌。

第三節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器國外技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀

一些最新的生物反應(yīng)器開發(fā)實(shí)例有：日本的三井石油公司開發(fā)的兩槽培養(yǎng)系統(tǒng)可用于較一般的植物細(xì)胞培養(yǎng)場合；Jolicoeur等開發(fā)了工作容量為1lL的雙螺旋帶形攪拌漿反應(yīng)器(dlouble halieal-ribbon impeller biloreabor)用于長春花細(xì)胞的高密度培養(yǎng)獲得成功；Kim等將雙重中空纖維反應(yīng)器 (dual hollow fibre reactor)用于長春花細(xì)胞的固定化培養(yǎng)以維持高濃度和連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)。

Inoue等人 研究 開發(fā)了一種新穎的中空纖維生物反應(yīng)器，用于重組動物細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)。該裝置由中空纖維反應(yīng)器和灌流系統(tǒng)組成。液體通過泵在反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)，灌流系統(tǒng)補(bǔ)充或置換培養(yǎng)介質(zhì)及移出代謝物。細(xì)胞在中空纖維膜的一側(cè)生長，培養(yǎng)介質(zhì)在膜的另一側(cè)通過擴(kuò)散向細(xì)胞傳遞營養(yǎng)。該反應(yīng)器能為細(xì)胞提供一個溫和的生長環(huán)境。用泵控制培養(yǎng)介質(zhì)在反應(yīng)器內(nèi)循環(huán)。培養(yǎng)液在中空纖維腔內(nèi)流動并通過中空纖維膜向另一側(cè)供應(yīng)細(xì)胞生長所需的養(yǎng)分。通過培養(yǎng)30 d后，單克隆抗體hMAb濃度達(dá)250μg／ml。重組的細(xì)胞BHk-21密度達(dá)2.1×106個／CM3。

Fang等人用旋轉(zhuǎn)壁生物反應(yīng)器(Rotating_wallBio—reactor)培養(yǎng)細(xì)胞。旋轉(zhuǎn)壁生物反應(yīng)器的培養(yǎng)室可以饒縱軸或橫軸旋轉(zhuǎn)。細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器內(nèi)一方面受到自身重力的沉降，同時受到離心力的作用，兩者達(dá)到平衡。從而使細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)受到較小的剪切力，其大小還不到在普通反應(yīng)器里培養(yǎng)時所受到的1/10。另外，該反應(yīng)器還有利于營養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)及廢物的排放。實(shí)驗(yàn)表明，旋轉(zhuǎn)壁生物反應(yīng)器非常適合動物細(xì)胞生長。

第四節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器技術(shù)開發(fā)熱點(diǎn)、難點(diǎn) 分析

培養(yǎng)系統(tǒng)中由于細(xì)胞生長和次生產(chǎn)物合成不相藕合，批式培養(yǎng)系統(tǒng)逐步發(fā)展成為補(bǔ)料批式和多步批式培養(yǎng)系統(tǒng)。要實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)過程的在線檢測，包括對溫度(T)、溶氧量(DO)、pH值、泡沫及細(xì)胞濃度(光密度法)、氧氣和二氧化碳濃度比 (O2／CO2)等的檢測，另外要實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)過程無故障及雜菌污染。反應(yīng)器的設(shè)計(jì)與改進(jìn)應(yīng)綜合考慮氧傳輸、混合性能和剪切力強(qiáng)度，包括改變氣體交換器構(gòu)型、攪拌器構(gòu)型、擋板的位置與數(shù)目甚至反應(yīng)器的構(gòu)型等因素。利用二相(溶劑相和水相)培養(yǎng)的反應(yīng)器系統(tǒng)可以使產(chǎn)物及時與反應(yīng)物分離，避免了產(chǎn)物的抑制效應(yīng)，能提高培養(yǎng)效率。通過自由振蕩或采用DNA合成的選擇性抑制劑處理細(xì)胞，如不同時期細(xì)胞繼代培養(yǎng)和延遲生長素的添加，誘導(dǎo)細(xì)胞同步分裂，可以使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)的利用和產(chǎn)物的合成達(dá)到最大化，從而提高反應(yīng)器的生產(chǎn)性能。Kitkby和Faraday采用反應(yīng)器的進(jìn)料振蕩而使細(xì)胞生命的循環(huán)趨于同步，最終反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞處于同一生長階段，在設(shè)定的時間下從反應(yīng)器內(nèi)獲得較高的目的產(chǎn)物濃度，生產(chǎn)效率提高50％，這是植物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的一個嶄新的思路。

植物細(xì)胞培養(yǎng)這一領(lǐng)域的重大發(fā)展要求生物學(xué)和工程As含量，因此TF主要由地上部As的含量所決定。根系對As的吸收能力SAU主要由根部As的含量所決定，二者呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.903，但與根部生物量相關(guān)性并不顯著，這主要是由于根部質(zhì)量較小以及各品種問差異不顯著所造成的。

第五節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器未來技術(shù)發(fā)展趨勢

1、探索多種細(xì)胞培養(yǎng)方式。生物反應(yīng)器畢竟是動植物細(xì)胞培養(yǎng)的基本裝置，同樣的設(shè)備在采用不同的操作方式，可以達(dá)到不同的效果。

2、與下游分離技術(shù)結(jié)合，使細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)物提取在生物反應(yīng)器內(nèi)同步進(jìn)行。

3、現(xiàn)代基因工程技術(shù)發(fā)展迅速，轉(zhuǎn)基因藥物及食品不斷出現(xiàn)。所以，開發(fā)適合基因工程細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器也大有發(fā)展前景。

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